手性色谱柱

手性色谱柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。

界说：

通过引入手性环境使对映异构体间出现物理特征的差异，然后抵达光学异构体拆分的目的。要完成手性辨认，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种互相效果。这种互相效果包括氢键、偶极-偶极效果、π-π效果、静电效果、疏水效果或空间效果。手性分别效果是多种互相效果一同效果的效果。这些互相效果通过影响包埋复合物的构成，特别位点与分析物的键合等而改动手性分别效果。由于这种效果力较微弱，因此需求细心调理、优化活动相和温度以抵达*佳分别效果。

分类及运用：

迄今为止，尚没有一种相似十八烷基键合硅胶（ODS）柱的广泛适用的手性柱。不同化学性质的异构体不得不选用不同类型的手性柱，而市售的手性色谱柱一般价格昂贵，因此怎么根据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱对错常重要的。

分类体系：

根据手性固定相和溶剂的互相效果机制，Irving Wainer初度提出了手性色谱柱的分类体系：

第1类：通过氢键、π-π效果、偶极-偶极效果构成复合物。

第2类：既有类型1中的互相效果，又存在包埋复合物。此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。

第3类：根据溶剂进入手性空穴构成包埋复合物。这类手性色谱柱中*典型的是由Armstrong教授开发的环糊精型手性柱[2]，其他冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）构成的手性色谱柱也归于此类。

第4类：根据构成非对映体的金属络合物，是由Davankov开发的手性分别技术，也称为手性配位沟通色谱（CLEC）。

第5类：蛋白质型手性色谱柱。手性分别是根据疏水互相效果和极性互相效果完成。

可是，随着由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多，此分类体系有时很难将一些手性柱概括进去。因此参看Irving Wainer的分类方法，根据固定相的化学结构，将手性色谱柱分为以下几种：

刷（Brush）型或称为Prikle型

纤维素（Cellulose）型

环糊精（Cyclodextrin）型

大环抗生素（Macrocyclicantibiotics）型

蛋白质（Protein）型

配位沟通（|Ligandexchange）型

冠醚（Crown ethers）型

1、刷型：

刷型手性色谱柱的出现和展开源于Bill Prikle及其搭档的卓越作业。六十年代，Bill Prikle将手性核磁共振中的效果运用到手性HPLC固定相研讨中，通过不断实践，发清楚运用规划较广、柱效很好的手性色谱柱。刷型手性色谱柱是根据三点辨认方式规划的，归于Irving Wainer分类中的*种类型。

刷型手性固定相分为π电子接受型和π电子供应型两类。*常见的π电子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸键合到γ-氨丙基硅胶上的制成。此类刷型手性色谱柱可以分别许多可供应π电子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等对化合物进行衍生化后进行手性分别。

π电子供应型固定相常见的是共价结合到硅胶上的萘基氨基酸衍生物，这种固定相要求被分析物具有π电子接受基团，例如二硝基苯甲酰基。醇类、羧酸类、胺类等，可以用氯化二硝基苯甲酰、异腈酸盐、或二硝基苯胺等进行衍生化后，用π电子供应型固定相抵达手性分别。

刷型固定相的优势在于其易于组成。组成方法在Bill Prikle的著作中有详细的阐明。其他，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的选择因子。它的晦气之处在于它仅对芳香族化合物有用，有时不得不进行衍生化反响。但值得一提的是，这种衍生化反响对错手性衍生反响，所以不存在手性衍生的问题。刷型手性色谱运用的活动相基本是极性弱的有机溶剂，这关于制备色谱来讲未必是缺点。

近来，刷型固定相出现了π电子供应和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分适用于β-阻断剂的手性分别。典型的活动相为二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例为85：10：5。参加10mM醋酸铵可以调整保存时刻。SS BLAMO Ⅱ，一同具有π电子供体区和受体区，构成手性裂缝，因此关于某些分子具有很高选择性。

2、纤维素型：

纤维素型手性色谱柱的分别效果包括互相招引的效果及构成包埋复合物。它们归于Wainer分类中的第2种类型。市售的手性色谱柱为微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸盐纤维素固定相。许多化合物可通过此类型的色谱柱得到分别。这种类型的手性色谱柱种类也很齐全。活动相运用低极性溶剂，典型的活动相为异丙醇-正己烷混合物。这类柱子根据制作工艺，分为涂敷与键合两大类。但特别要注意由于氯可以使涂敷纤维素从硅胶上坠落，因此要保证涂敷类柱子活动相中无含氯溶剂。

3、环糊精型：

环糊精是通过BacillusMacerans 淀粉酶或环糊精糖基转移酶水解淀粉得到的环型低聚糖。通过操控环糊精转移酶的水解反响条件可得到不同尺度的环糊精。市售的环糊精首要是α、β、γ三种类型，分别含6、7、8个吡喃葡萄糖单元。环糊精分子成锥筒型，构成一个窟窿，窟窿的孔径由构成环糊精的吡喃葡萄糖的数目抉择。环糊精类型及窟窿的孔径等见下表：

环糊精 糖元数目 窟窿孔径 可进入窟窿的分子类型，手性中心数目

α 6 4.5-6.0 5-6元环的芳香族化合物，30

β 7 6.0-8.0 联苯或萘， 35

γ 8 8.0-10.0 代替芘和类固醇， 40

2，3位仲羟基分布在环糊精洞口，6位伯羟基在环糊精分子的外部，这意味着窟窿内部是相对疏水的区域。用环糊精手性固定相产生手性辨认要求被拆分物的疏水部分能嵌入环糊精窟窿中，构成可逆的、安稳性不同的包合物，环糊精洞口的羟基和被拆分物的极性基团互相效果。

由于构成包合物速度较慢，因此或许导致色谱峰峰形较差，相同也影响了其在制备色谱中的运用。环糊精固定相的选择性取决分析物的分子巨细；α-环糊精只能容许单苯基或萘基进入，β-环糊精容许萘基及多代替的苯基进入，γ-环糊精仅用于大分子萜类。β-环糊精手性固定相运用规划*广。Ibuprofen通过β-环糊精色谱柱得到分别，阐清楚pH值对氢键的影响。当活动相的pH=7时，观察不到拆分的痕迹。pH=4时，可抵达好的分别效果。一般分别氨基酸时，常选用低的pH值，以按捺酸性基团的离子化，一同也增强氨基的质子化。磷酸三乙胺盐、乙酸三乙胺盐证明对β-环糊精色谱柱来说是很好的缓冲液。一般缓冲液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸调理到适宜的pH值。高的流速会下降构成复合物的才能，低流速分别效果较好，0.5-1ml/min的流速*好。其他，增加缓冲液的浓度可以克服流速的影响，由于它可以增加环糊精窟窿和活动相的招引力。

常用缓冲液及其运用浓度如下表所示：

缓冲液 浓度 目的

TEAA（乙酸三乙胺盐） 0.01-2%

NH4NO3 10-500mM (用于减小包埋)

柠檬酸盐 10-200mM (特别适合于酸性化合物)

醋酸铵 10-200mM

pH值选择见下表:

缓冲液 pH值 目的

醇和胺 pH4 (加强NH的离子化)

酸 pH7

优化手性分别条件要考虑的方面有：pH值对分别度的影响；流速对分别度的影响；柱温、有机相比例、缓冲盐浓度对分别度的影响。

环糊精的修饰：*近，对环糊精的修饰使环糊精型手性色谱柱可以分别更多的化合物，并可用于气相手性色谱分别。衍生化是通过将不同的基因键合到环糊精窟窿表面的羟基上。衍生化反响包括乙基化、S-羟基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸盐、3，5二甲基苯基氨基甲酸盐和环状对甲苯酰酯。这些新式的环糊精固定相有许多长处，它们可以分别更多化合物，价格上也有竞争力，由于改进了手性辨认才能使其更适用于制备色谱。

4、配位沟通型：

手性配位沟通色谱（Chiral LigandExchange Chromatography，CLEC）由

Davankov发明，是通过构成光学活性的金属络合物而抵达手性分别，归于Irving Wainer分类中的第4类手性固定相，首要用于分别氨基酸类。

由于此类固定相是由手性氨基酸—铜离子络合物键合到硅胶或聚合物上形

成，因此活动相中有必要含有铜离子以保证手性固定相上的铜离子不至流失。其它的过渡金属元素也已用于手性配位沟通色谱，但铜离子运用*广。构成络合物的过程十分缓慢，因此有时需提高柱温，*佳温度约50℃。

手性配位沟通色谱仅对α- 氨基酸和其相似物有用。β- 氨基酸很难用手性

配位沟通色谱得以分别。手性配位沟通色谱可用于制备，由于活动相中存在铜离子，尽管铜离子能用离子沟通柱除掉，但增加了样品处理的困难。

5、大环抗生素型：

大环抗生素型手性色谱柱是*近展开起来的，通过将大环抗生素键合到胶

上制成的新式手性色谱柱。大环抗生素型手性色谱柱的出现归功于Dan Armstron 的奉献。此类色谱柱常用的大环抗生素首要由三种：利福霉素（Rifamycin），万古霉素（Vancomycin），替考拉宁（Ticoplanin）。利福霉素作为手性增加剂在毛细管电泳分别手性化合物方面得到了成功运用。万古霉素和替考拉宁分子结构中存在“杯”状结构区和糖“平面” 结构区。此类色谱柱性质安稳，可用于多种分别方式。手性分别根据氢键、π-π效果、构成包合物、离子效果和肽键等。

替考拉宁分子量为1885，结构中存在20个手性中心，3个糖基和4个环。酸性基团在多肽“杯”/ “裂层”的一端，碱性基团在它的另一端。酸性基团和碱性基团供应了离子效果点。糖基在三个平面上，可折叠起来将化合物分子包埋在多肽“杯”中。

万古霉素分子量为1449，结构中存在18个手性中心，3个环。万古霉素具有“篮状”结构，它的邻近还有一个可曲折的糖平面，可将分析物分子包埋在“篮子”中。羧基和仲氨基分布在“篮子”的边际，参加和分析物分子产生离子效果。万古霉素手性色谱柱可用于反相方式、正相方式和极性方式。万古霉素手性色谱柱可以分别胺类、中性酰胺、脂类。但关于酸性化合物选择性较低。在反相方式中，有机相常用四氢呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸缓冲液。色谱柱适用的pH规划为4-7。一般优化碱性化合物手性分别条件时，选择pH=7 为起点比较好。其他四氢呋喃、乙腈有*好的选择性。有时选用纯的甲醇和乙醇作活动相也可抵达好的分别效果。万古霉素手性色谱柱也可用正相方式，选用正己烷/乙醇为活动相。

万古霉素手性色谱柱载样量可以很大，十分适用于制备色谱。

6、蛋白质型：

蛋白质型手性色谱柱归于第5种类型。分别依赖于疏水互相效果和极性互相效果。已经有多种蛋白质用于此类手性色谱柱。运用较多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵类粘蛋白（Ovomucoid，OV）。

α-酸性糖蛋白分子由181个氨基酸残基和40个唾液酸（sialic acid）残基构成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等电点为2.7。含有两个二硫键，性质很安稳。α-酸性糖蛋白分子可以共价键合到硅胶上，制成手性色谱柱，可以分别许多化合物。

α-酸性糖蛋白手性色谱柱运用的活动相一般为pH 4-7的磷酸盐缓冲液和很小比例的有机相。有机相首选异丙醇，如达不到分别要求，可以尝试乙腈，乙醇，甲醇或四氢呋喃。有机相的改动导致蛋白结构产生暂时的改动。色谱柱的负载量至关重要，典型的负载量为0.02mg/ml的浓度样品，进样20μl。pH 的改动对手性选择性起关键效果，尤其是胺类化合物。pH下降导致蛋白质负电荷的下降，引起胺类化合物保存时刻减小，然而这意味着可以减小有机相比例，使选择性增加，峰形改进。

通过调理有机相比例仍无法抵达分别效果时，有时需用电荷调理剂。但这或许引起蛋白结构的永久改动，这些电荷调理剂包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有时也用到1，2 亚乙基二醇，1，2丁醇和氯化钠。温度对分别也有影响，温度增加保存时刻，减小分别因子。

人血清白蛋白（HSA）分子量为69,000，等电点为4.8。蛋白中认为存在两个药物结合位点：华法则-氮杂普鲁帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基二氮杂-吲哚（benzodiazapine-indole）结合位点。活动相中参加辛酸，选用人血清白蛋白手性色谱柱可以有用分别benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色谱柱得到了分别，活动相组成为：100mM磷酸缓冲液pH7：乙腈：异丙醇 = 84：10：6。

牛血清白蛋白（BSA）为球型蛋白，分子量为66,000，等电点为4.7。此蛋白为一个单氨基酸链，通过17个二硫键构成9个双环。许多化合物通过牛血清白蛋白手性色谱柱得到分别。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白安稳，一些有机溶剂（如乙腈、甲醇）可使蛋白变性，因此运用起来要特别注意。

卵类粘蛋白由蛋清中提取，分子量为55,000。它可分别很多的胺类和酸类化合物。

蛋白手性色谱柱的载样量均较小。影响了蛋白手性色谱柱在制备色谱中的运用。

蛋白手性色谱柱在所有手性色谱柱中是运用*广的色谱柱，但并不是效果*好的色谱柱。

7、冠醚型：

冠醚类固定相用于分别一级胺，一级胺有必要质子化方能抵达分别。因此有必要

运用酸性活动相，如高氯酸。*常用的是冠醚类固定相是18-冠-6，已有商品化

产品，由Daicel公司制作。不管（+）或（-）型均可抵达有用分别，并可通过改动（+）（-）类型而改动分析物出峰顺序。冠醚作为增加剂也用于核磁共振和电泳，但由于其毒性较大，有致癌性，使其运用受到限制。